Plant Diversity ›› 2009, Vol. 31 ›› Issue (1): 75-81.DOI: 10.3724 SP.J.1143.2009.08142
TaqMan 荧光定量RT-PCR 检测水稻RAc1基因mRNA 方法的建立
高 东, 王云月, 何霞红, 李成云, 朱有勇
Establishment of Real-time TaqMan-Fluorescence Quantitative RT-PCR Assay for Detection and Quantification of mRNA Expression of RAc1 of Rice
GAO Dong, WANG Yun-Yue, HE Xia-Hong, LI Cheng-Yun , ZHU You-Yong
摘要: 构建包含RAc1 基因cDNA 片段的质粒, 作为水稻肌动蛋白基因RAc1 之mRNA 定量检测的标准品,建立检测方法, 为水稻其他基因的定量建立内参。从水稻叶总RNA 中逆转录扩增总cDNA, PCR 扩增RAc1基因中设计的目的片段, 将纯化的目的片段与pMD19-T Simple 载体进行连接, 转化宿主菌JM-109 , 提取重组质粒DNA, PCR 鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260 nm 吸光值, 确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR 梯度浓度标准品, 进行实时荧光定量PCR 实验。建立了RAc1 基因mRNA 表达实时荧光定量PCR 检测方法, 特异性好, 检测灵敏度达102 拷贝, 线性范围为102 ~107 拷贝, 阈值循环数(Ct )与PCR 体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系( r= 1.000 ), 扩增效率高(E= 98. 2% )。建立了基因RAc1 实时定量PCR 的质粒标准品。
中图分类号: